Стандартный анализ крови обязательно включает в себя показатель уровня гемоглобина. Такой анализ называется клиническим и является базой для исследования практически всех заболеваний. Белок гемоглобин находится в клетках крови – эритроцитах. Он выполняет важную функцию клеточного дыхания. Благодаря железу, которое в нём содержится, кровь имеет красный цвет. Колориметрический принцип определения уровня гемоглобина основан именно на таком свойстве пигментации. Как делать такой анализ предложил швейцарский врач Герман Сали (Herman Sahli) в конце 19 века.
Принцип проведения
Определение количества гемоглобина по методу Сали является классическим, его до сих пор используют во многих лабораториях. Гемоглобин – это сложный белок из группы гемопротеинов. Он состоит из двух компонентов: белкового глобина и небелкового гема. Одна молекула гемоглобина содержит 4 гема. В центре каждого из них находится атом железа, который умеет обратимо соединяться с атомами кислорода и углекислого газа, при этом не окисляясь. Именно наличие этого элемента в крови придаёт ей характерный цвет.
Принцип проведения исследования
В основе метода Сали лежит простая реакция преобразования гемоглобина. Для этого в препарат крови добавляется определенное количество хлористоводородной кислоты. В результате в пробирке образуется вещество хлоргематин, коричневого цвета.
Определить содержание преобразованного гемоглобина можно по интенсивности окраса полученной смеси. Для этого раствор разбавляется дистиллированной водой, пока его оттенок не станет идентичным веществу в контрольной запаянной пробирке.
Важно! Со временем содержимое контрольных препаратов выцветает. В результате может быть отклонение полученных данных от реальных показателей на 1-3%.
Что представляет собой гемометр Сали
Для подсчёта уровня гемоглобина используют прибор, который изобрёл швейцарский диагност. Гемометр Сали состоит из трёх пробирок одинакового размера. Две пробирки запаяны и наполнены раствором крови в соляной (хлороводородной) кислоте. Такая смесь носит название гематин и имеет коричневый оттенок. Интенсивность цвета зависит от количества гемоглобина. В запаянных пробирках гемометра цвет соответствует стандарту содержания гемоглобина в крови здорового человека.
На заметку! Норма гемоглобина в крови мужчин составляет 130-160 г/л, у женщин – 120-140 г/л.
Третья пробирка имеет шкалу, на которой отмечены грамм-проценты и единицы гемометра. Эта ёмкость заполняется анализируемым материалом. Колориметрический анализ производится лаборантом визуально. Анализируемый гематин разбавляют водой до определённого цвета, который сравнивают со стандартным образцом.
Гемометр Сали для определения уровня гемоглобина
Чтобы упростить проведение лабораторного анализа был разработан гемометр Сали, который включает:
- штатив с 3 вертикальными гнездами;
- 2 запаянные пробирки со стандартными жидкостями;
- открытую градуированную пробирку;
- капилляр (0,2 мл);
- пипетку для воды;
- стеклянную палочку для перемешивания.
Методика проведения
Для проведения лабораторного исследования крови по методу Сали осуществляют следующие действия. Пустую пробирку гемометра заполняют соляной кислотой до нижней отметки. Концентрация раствора должна составлять 0,1 Н. Далее специальным капилляром, который входит в комплект гемометра, набирают 0,02 мл крови пациента.
Капилляр опускают в кислотный раствор и аккуратно выпускают в него, забранный у пациента, материал. Кровь должна оказаться под слоем кислоты так, чтобы сама кислота осталась прозрачной. Далее содержимое пробирки перемешивают и выдерживают в нетронутом состоянии 5-15 минут. За это время произойдёт взаимодействие жидкостей, и образуется гематин коричневого цвета.
В образовавшееся вещество по капле добавляют дистиллированную воду, пока цвет не станет идентичным с цветом образца в запаянной пробирке гемометра. Каждый раз гематин размешивают стеклянной палочкой. При этом жидкость поднимается, её уровень соответствует шкале контрольной пробирки. Как только цвет анализируемого материала сравняется со стандартным цветом, лаборант отмечает, какому делению шкалы грамм-процентов соответствует поднявшаяся жидкость. Для перевода в необходимые граммы на литр полученную цифру умножают на 10.
Определение содержания гемоглобина в крови по методу Сали
В крови содержится в среднем 14 г % гемоглобина, у женщин — 12 — 15, у мужчин — 13 -16 г % (соответственно 120- 150 и 130- 160 г/л). Определение количества гемоглобина имеет большое значение и является обязательным компонентом анализа крови. Гемоглобин определяется колориметрическими методами. В настоящее время метод Сали в клинике применяется редко, так как существуют более точные методы с помощью фотоэлектроколориметров. Гемометр Сали используют в учебных целях.
Метод Сали основан на превращении гемоглобина в хлорид гематина коричневого цвета при добавлении к крови хлористоводородной кислоты. Определение гемоглобина производят колориметрическим способом, основанным на следующем принципе: если исследуемый раствор путём разбавления довести до окраски, одинаковой со стандартным раствором, то концентрация растворённых веществ в обоих растворах будет совпадать, а количества веществ будут соотноситься как их объёмы. Зная количество гемоглобина в стандартном растворе (16,7 г%, что принято за 100% гемоглобина), легко вычислить его содержание в исследуемом растворе в относительных процентах.
Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из матового стекла. В штатив вставлены три пробирки одинакового диаметра. Две крайние запаяны и содержат раствор солянокислого гематина, средняя градуирована и открыта. Она предназначена для исследуемой крови. К прибору приложены капилляр (с меткой 20 мм3), стеклянная палочка и пипетка.
Цель работы: определить содержание гемоглобина в крови по методу Сали.
Оснащение: гемометр Сали, стерильный скарификатор, 0,1% раствор HCI, фильтровальная бумага, вата, спирт, эфир, йод, дистиллированная вода. Объект исследования — человек.
Проведение работы. В среднюю пробирку гемометра наливают раствор HCI до нижней кольцевой метки. Затем из пальца обычным способом набирают кровь в капилляр до метки, удаляя излишек с помощью фильтровальной бумаги. Выдувают кровь на дно средней пробирки так, чтобы верхний слой соляной кислоты оставался неокрашенным. Не вынимая пипетки, ополаскивают её соляной кислотой из верхнего слоя.
После этого содержимое пробирки перемешивают, ударяя пальцем по её дну, и оставляют стоять на 8-10 минут. Это время необходимо для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин. Затем к раствору добавляют по каплям дистиллированную воду до тех пор пока цвет полученного раствора не будет одинаков с цветом стандартного (добавляя воду, раствор перемешивают стеклянной палочкой).
Цифра, стоящая на уровне нижнего мениска полученного раствора, показывает содержание гемоглобина в граммах на 100 г исследуемой крови (при переводе в единицы СИ полученную цифру умножают на 10, получая величину гемоглобина в граммах на 1 л крови). Можно вычислить также относительное содержание гемоглобина в исследуемой крови.
Оформление протокола. Запишите, каково содержание гемоглобина в исследуемой крови. Вычислите относительное процентное содержание гемоглобина следующим образом. Допустим, количество гемоглобина в крови соответствует 14 делениям гемометра. Тогда по пропорции вычисляем относительное содержание гемоглобина в процентах. Сравните полученное значение с нормой.
16,7 г % — 100 %
14,0 г % — х
х =(100-14,0)/16,7
Насколько точный метод определения гемоглобина
Швейцарский диагност изобрёл свой способ определения гемоглобина в крови в конце 19 века. На тот момент этот способ был самым точным. Но новые исследования, открытия в области медицины и молекулярной диагностики создали новые методы. Появились аппаратные методики, которые исключают человеческий фактор при исследованиях. Они способны оценивать биологический материал при помощи более точных замеров.
Недостатки метода Сали
Этот способ определения количества гемоглобина в крови не получил распространения в странах СНГ. У него есть несколько серьезных недостатков:
- Время. На изучение крови 1 пациента затрачивается не менее 20 минут. При этом использование автоматизированных систем позволяет получить результат за несколько секунд.
- Субъективность. Хроматическая методика Сали тесно связана с индивидуальным восприятием цвета. Соответственно, результаты могут различаться даже у 1 лаборанта в зависимости от внешних факторов.
- Точность. Стандартная погрешность метода — 3 г/л. При использовании старых образцов контрольных пробирок, высоком содержании билирубина в крови и при плохом освещении результат определения уровня гемоглобина может отличаться еще больше, вплоть до 30% от реальных показателей.
Ветеринария и зоотехния
В качестве унифицированного утвержден гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина крови. Определение гемоглобина с помощью гемометра Сали (ГС-3) может быть использовано ишь в отсутствие фотоэлектроколориметра, гемоглобинометра1 или спектрофотометра.
Метод Сали.
Принцип. Гемоглобин крови под воздействием 0, 1 н. раствора хлороводородной кислоты превращается в хлорид гематина бурого цвета, интенсивность окраски его сравнивают со стандартом.
Ход определения. В каплю взятой крови, находящуюся в углублении пластинки, вносят кончик чистого и сухого капилляра от гемометра. Плавно, без перерывов, с помощью резинового баллона насасывают кровь в капилляр до круговой метки (0, 02 мл). Уровень крови в капилляре регулируют, прикасаясь к его кончику ватой или фильтровальной бумагой. Вытирают кончик капилляра от крови и вносят его в 0, 01 н. раствор хлороводородной кислоты, находящийся в градуированной пробирке, выпуская кровь в реактив тонкой струйкой, не взмучивая жидкость. Не удаляй капилляр из пробирки, его прополаскивают 2—3 раза надосадочным прозрачным 0, 1 н. раствором хлороводородной кислоты, затем извлекают из жидкости, прикасаясь его кончиком к стенкам пробирки, выдувают остаток жидкости и выносят из пробирки. Кровь с хлороводородной кислотой немедленно смешивают, энергично встряхивая содержимое пробирки. Вследствие гемолиза эритроцитов и образования хлорида гематина жидкость буреет и становится прозрачной. Пробирку от гемометра, на которой нанесена шкала, градуированная в грамм-процентах, через 5 мин после смещения вставляют в гемометр Сали, имеющий два стандарта. Через 5 мин к испытуемой жидкости небольшими порциями прибавляют дистиллированную воду, каждый раз тщательно перемешивая жидкость с помощью стеклянной палочки. Стекающая с палочки жидкость должна полностью остаться в пробирке. В момент, когда цвет жидкости приблизится к цвету стандартов, воду начинают прибавлять осторожно, по каплям. Разведение заканчивают, как только цвет испытуемой жидкости сравняется с цветом стандартов. Цвет жидкости стандартов сравнивают при дневном освещении в проходящем свете, держа в вытянутой руке на уровне глаз. Определяют, какому делению шкалы соответствует нижний мениск жидкости. Цена деления шкалы равна 0, 2 г %. Количество гемоглобина при оформлении в бланке анализа записывают в граммах на 1 л, для чего полученные данные умножают на 10. После определения гемоглобина пробирку и капилляр промывают дистиллированной водой, высушивают, а гемометр укладывают в футляр.
Руководство к практическим занятиям по методам клинических клинических лабораторных исследований: Учеб. Пособие -4-е изд., перераб. И доп.-В.С. Ронин, Г.М. Старобинец.-М.: Медицина, 1989.-320с.
